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    科普知识

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    第一节 微生物学

    时间:2018-01-24

    一、狂犬病病毒在分类学中的位置

    狂犬病病毒归属在弹状病毒科(Rhabdoviridae),弹状病毒科内几乎所有的病毒都是弹状或杆状形态,具有相似的蛋白与RNA结构;可分为5~6 个属,能感染人致病的仅如下两属,其一是水泡性口炎病毒属,属内典型的病毒是水泡性口炎病毒(VSV);其二是狂犬病病毒属 (Lyssaviruses),代表种是狂犬病病毒。

    从昆虫、蝙蝠、鼩鼱、人体内曾分离到几种狂犬病病毒样病毒,称为狂犬病相关病毒(Rabies-Related Virus,RRV),RRV不一定都会引发狂犬病样疾病,但它们都具有与典型狂犬病病毒相同的核衣壳抗原,差异在于糖蛋白的抗原性。于1979年将它们 分类在狂犬病病毒属;目前,可将狂犬病病毒属分为7个血清型。第l血清型,代表株是CVS24,包括野毒株及各实验室保存的大部份毒株,是典型狂犬病病 毒。第2~7血清型是RRV;第2血清型,代表株是Lagos蝙蝠病毒;第3血清型,代表株是 Mokola病毒;第4血清型,代表株是Duvenhage病毒;第5血清型,代表株是欧洲蝙蝠病毒-1(EBL-1)从俄国人体中分离;第6血清型,代 表株是欧洲蝙蝠病毒-2(EBL-2),从芬兰人体中分离;第7血清型,代表株是从澳大利亚蝙蝠中新分离的。现有证据表明仅第l血清型病毒与人类狂犬病密 切相关,但有学者认为,除了第2血清型之外,其它血清型病毒均可导致人或动物感染死亡,例如Mokola病毒引起曾接种过狂犬病疫苗的狗、猫发生致死性感 染。

    在属内尚有基因分型的提法,第1~7基因型与第l~7血清型基本是对应的?;褂兄秩海╬hylogroup)的提法,按中和性单克隆抗体(McAb)的交 叉反应性及跨膜糖蛋白涉及的病毒-宿主互相作用性、免疫原性、致病性,可分为两个种群,第一群包括第1、4、5、6、7基因型,第二群包括第2、3基因 型。用第二群病毒对小鼠进行外周攻击,无致病性(5)。

    二、病毒的性状

    (一)形态结构

    狂犬病病毒典型的形态是一端平坦或略凹状,另一端半圆形,酷似子弹,故得名弹状病毒。病毒大小为75~80×170~180nm。经组织培养 后,病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒。电镜下可见病毒内部有50nm宽的核心,核心实质为核衣壳。

    核衣壳由单股 RNA与核蛋白(N)组成,并与NS蛋白、多聚酶L蛋白缔结为核糖核蛋白体(RNP);在RNP中,RNA呈螺旋对称排列、宽度18nm,被N 蛋白紧紧地镶嵌着;在RNP外面包围着一层基质(M)蛋白膜。再向外就是脂双层外包膜(Envelope),在其表面上排列着有间距性的刺突,刺突是糖蛋 白(G)构成的三聚体、长约10nm;这种三聚体性刺突,也称为,刺突样的外包膜表面G蛋白突起(peplomers)。见图4-6-l。

    (二)化学组成及其功能

    狂犬病病毒除含有 RNA和蛋白质以外,尚含有类脂、碳水化合物。其含量比例为:脂类15~25%,糖3%,RNA约为3~4%,蛋白质65~75%。

    l.病毒RNA 构成病毒基因组的是单股负链RNA。分子量3.5~4.6×106道尔顿、约为12Kb,PV株含11932个核苷酸;其中含有5个结构基 因,从3’端起,依次为核蛋白基因含1424个核苷酸、非结构蛋白(NS、或称P、M1)基因含991个核苷酸、基质蛋白(M2)基因含 805个核苷酸、糖蛋白基因含1674个核苷酸、大蛋白(L)基因含6475个核苷酸。在G与L基因之间存在一个不翻译的伪基因(ψ),这是与 VSV最大的区别,而且在负链病毒基因组中也是罕见的。在各结构基因之间均有一个核苷酸个数不等的间隔区,从3’端N基因下游开始,依次为 2、5、5、423个核苷酸。在结构基因区的两端还各有一段意义不明的片段,分别为3’端的58或56个核苷酸,亦称先导RNA; 5’端的70个核苷酸。见图4-6-2。

    2.病毒蛋白质 有5种主要的病毒蛋白,据化学性质可分为磷酸化蛋白与非磷化蛋白,以及糖蛋白等。它们在病毒的感染、复制、致病与免疫等功能方面起重要的作用。不同来源的 病毒株其结构蛋白的分子量是略有不同的。这五种病毒蛋白分列于表4-6-l。

    G蛋白是唯一暴露在病毒体外部的病毒蛋白。据其可弯曲铰链分为两个部分,含三个抗原表位区,某些株如ERA却有五个抗原表位区;①NH2端区部(Ⅱ区): 含抗原Ⅱ表位区直到线性区253~275位氨基酸,包括Ⅵ表位264位氨基酸;②COOH端区部(Ⅲ区):含抗原Ⅲ表位区及跨膜区、胞浆区,Ⅲ表位区中 AflⅢ的第333位氨基酸残基是决定毒力的关键性氨基酸;此位点氨基酸的改换,会减弱病毒在细胞间的扩散,并限制病毒在CNS中的复制。

    G蛋白的作用:①与病毒对细胞的吸附以及介导细胞摄取病毒有关;②它的胞浆功能区必须优先与RNP-M复合体相互作用,才利于病毒出芽,两者错配则足于使 病毒减毒(6);③G蛋白过量表达会引起受感染神经元的机能损害,而且G蛋白过量表达或大量堆积会造成神经元细胞凋亡。反之则会损害病毒体的自身功能。

    另外,在组织培养中存在着大量的可溶性G蛋白(Gs),它是由细胞直接分泌至培养液中的游离物,Gs的羧基端比正常G蛋白少58个氨基酸,分子量为 61kDa。Gs的免疫原性较差,免疫动物后,不能?;ざ锩馐苤滤佬圆《竟セ?。

    3.病毒的脂类与糖类 病毒的糖类,主要与蛋白结合成糖蛋白,其次则是与脂类结合而成的糖脂,糖脂是构成包膜的一种成分。病毒的脂类,有磷脂、糖脂等极性脂肪,中性脂肪的主要成 分为胆固醇,脂类物质是构成病毒包膜的主要成分之一??袢〔《臼峭ü鲅糠绞绞头?,病毒的包膜是来自内质膜,故每株病毒在不同的宿主细胞内复制后,其脂 类成份及其含量比例都有所不同。病毒的形态、抗原性、吸附、脱壳都与包膜有很大程度的关联。

    (三)某些理化特性

    完整病毒体的等电点为:6.7~6.9;沉降系数为600~625S;悬浮密度,在氯化铯中为1.16~1.2g/cm3;在蔗糖中为1.14~1.17g/ml。

    三、病毒的特性

    (一)生物学特性

    1.组织嗜性 狂犬病病毒最大的特点之一,就是对神经组织的嗜性远远大于其它组织。在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高。无论是野毒株还是减毒株,都具有嗜神 经组织的特性,仅程度略有差异。唾液腺对病毒的敏感性又比其它组织细胞高。

    病毒在神经细胞复制过程中可形成包涵体,亦称尼基氏小体(Negri body),包涵体在胞浆内形成,大小为2~30μm;形态可为球形、卵圆形。电镜观察可见,包涵体内含有完整的病毒体以及病毒核衣壳的大基质、外 壳蛋白等。包涵体主要在大脑海马回部的锥体细胞、小脑的蒲肯野细胞、脊髓后角细胞、以及皮层神经元内出现,它可作为狂犬病的确诊指标之一;此外,还可把有 尼基氏小体出现部位,看成为有活动性病毒复制的区域。

    2.抵抗力 狂犬病病毒对温度较敏感,60℃30秒、100℃2秒即可使病毒灭活。在20~22℃条件下1~2周、4℃时5~6周,其感染性几乎完全丧失。保存液内加 入正常血清或白蛋白可?;げ《镜母腥拘?。用中性甘油(50%)保存的感染组织块,在-20℃以下可保存4~5年。病毒悬液在冰冻或冷冻干燥条件下稳定,冻 干后4℃保存可达数年其感染性下降不明显。病毒对紫外线、日光也较敏感。甲醛、酚、β-丙内酯、三磷酸三丁酯、汞、50~70%乙醇、碘酊、肥 皂、20%乙醚、10%氯仿、胰酶、氧化剂、表面活性剂、有机溶剂、以及在溶液pH 3~11范围外的pH均可使病毒灭活。但硫柳汞、磺胺、抗生素等不能灭活病毒。

    据上述特性,病毒的保存多采用深低温如-70℃下加50%甘油保存,或者加小牛血清作为?;ぜ猎诘臀绿跫卤4?。生产疫苗用毒种多采用冷冻干燥法保存。

    (二)抗原组成

    以前认为狂犬病病毒抗原性是单一的,各株之间无型的差异,但以McAb分析研究之后,发现巴斯德毒株与其后代以及其它毒株的抗原差异较明显,在核衣壳上存 在着不同的抗原群。尽管存在着差异,但目前所使用的疫苗病毒对街毒是有交叉?;ぷ饔玫?。

    1.核衣壳抗原 即N蛋白抗原,①引出补体结合抗体,②是狂犬病病毒的属抗原、群抗原,可用于病毒的分类与鉴定。③是一种免疫?;ば钥乖?,也介导细胞免疫。

    2.糖蛋白抗原 它位于病毒包膜的刺突上,是一种免疫?;ば钥乖?,它还具有结构标志性抗原的性质。①引出中和抗体;同时也是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的靶点。②血清型 抗原是标志性抗原,可用于病毒学分类与流行病学的监测。③作为血凝素(凝集鹅红细胞),可引出血抑抗体。④它某一位点的氨基酸变化,是用McAb分析强毒 株与弱毒株分子差异的基础。

    3.第三类抗原 曾有报道,存在着第三种抗原,能引出细胞溶解性抗体,后者在补体的参与下,溶解受感染的细胞。最近,用McAb分析表明,此类抗原决定基 (epitope)与血凝素抗原决定基重叠。目前对它的本质尚不够了解。

    四、病毒的培养与病毒复制

    (一)病毒的培养

    1.病毒接种在哺乳动物脑内,经3~7天,病毒可在脑内增殖,取其脑组织匀浆离心后,即为所培养的病毒。

    2.用6~8天龄鸡胚或其它禽类的卵胚培养病毒,以绒毛尿囊膜腔接种法,在种毒后第8~10天,病毒生长增殖达到高峰,而胚胎发育却不受影响。

    3. 狂犬病病毒对所有的哺乳类动物的细胞及禽类胚胎细胞均敏感,病毒接种在细胞中,培养3~7天便可生长增殖,在不同的细胞中病毒生长增殖的速度与产量有较大的差异。

    (二)病毒的复制

    复制的某些特点:①快速吸附与穿入:一般认为病毒颗粒在30内分钟就能吸附到敏感的细胞上。②隐蔽期短:6~8小时。③复制周期完成时间:19~24小时,最快为6小时。

    病毒增殖性复制过程的九个步骤,依次为吸附、穿入、脱壳、转录、翻译、加工、复制、装配、成熟出芽。病毒与宿主细胞的吸附作用取决于病毒糖蛋白与细胞表面 受体等的相互作用与结合,例如,细胞表面的烟酸乙酰胆硷受体(NAchR)、神经细胞粘附分子(NCAM,即CD56)、以及碳水化合物(主要是糖脂 类)、磷脂、神经节苷脂、某种蛋白受体。病毒通过包膜与宿主细胞膜融合或者是病毒饮入(Viropexis) 进入宿主细胞。病毒体在细胞内降解、释出核衣壳,在某些酶的作用下脱壳;之后,病毒基因组转录与复制。转录翻译有关的酶,合成子代病毒蛋白,在胞浆内形成 核衣壳,核衣壳的堆集形成尼基氏小体;核衣壳与M蛋白结合进行装配,通过出芽的方式获得宿主细胞的生物膜,从而成熟为完整的子代病毒颗粒。

    五、病毒的变异

    RNA病毒具有高度的变异率,每株病毒普遍都由复杂群体组成,这可根据其基因组结构予以区分,在恒定环境条件下,这种群体保持相对的稳定??袢〔《疽彩?如此,在每一特定的狂犬病病毒株内,显性变异与特殊宿主相关,容易鉴定并易于与其它毒株区分开来,即使因偶发突变而可能不断地出现新的变种,但稳定的复杂 群体因其已适应于特定环境,故仍保持现状不变。

    病毒的减毒通常都来自于毒力株,经过选择性过程后,减毒株则由混合群体组成,虽含有次要变异体但仍可保留致病性。例如,CVS-24至少由两个具有不同致 病性质的变异体组成,如适应于BHK细胞的CVS-B2c与适应于神经组织的CVS-N2c,它们当中的任何一个都是依赖于环境的主要群体;但是CVS- N2c的神经嗜性和致病性却比CVS-B2c高50倍(7)。在每株病毒内,糖蛋白的变异可达10个氨基酸被替换,这可导致致病性减弱或丧失,例如, CVS-N2c的G蛋白功能区如果被SHBRV-18(R-N2cT)的G蛋白功能区代替之后,会使CVS-N2c在肌肉注入途径时失去致病性。

    虽然,我国的学者对不同地区分离的狂犬病病毒株进行了核酸测序分析,其结果表明不同地区的毒株是有区别,而且个别毒株的差异较大,但是,目前尚未发现,这些核酸序列的变异足于造成抗原性和免疫原性的重大改变。

    (一)街毒与固定毒

    这是两个概念不同的定义,街毒与固定毒的根本差别在于致病力的不同,而不是抗原性的不同。街毒:是指存在于自然界感染动物体内的病毒,亦称野毒,其对人致 病力强。固定毒:则指于实验室条件下街毒经过动物体内连续传代后而得之病毒;因其在动物体内连续传代后的潜伏期逐渐缩短至5-7天时,再也不缩短,呈有规 律的固定潜伏期,因之而得名;其对人致病力弱,但仍保持其原有的抗原性。街毒与固定毒各自的生物学特性见表4-6-2。

    现在世界各地实验室内保存的巴斯德毒株及其减毒株,最早从疯牛分离得到,在家兔脑内连续传90代以上而成为固定毒。我国用于疫苗生产的原始毒种 ——北京株,就是在从狂犬神经组织分离后,在家兔脑内连传50代所得的病毒。见表4-6-3。现在世界上多数固定毒均由这种家兔 脑内连续传代法获得,这是一种人工定向变异的减毒方法。

    我国学者对G蛋白的分子生物学分析显示,街毒与固定毒G蛋白的核酸序列同源性大都低于90%,最低者为82%;它们的氨基酸序列同源性约为90~93%。 在固定毒之间核酸序列同源性则都在90%左右。然而,与狂犬病病毒神经组织嗜性最为相关的是G蛋白第333位的氨基酸残基,即精氨酸(Arg333),如 果替换成赖氨酸(Lys333)或谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸后,病毒的毒力或嗜神经性会明显减弱。街毒G蛋白必定是Arg333,减毒株、无毒株以及部 分固定毒株此位点则为其它氨基酸如甘氨酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、蛋氨酸等所代替。此外,第330位的赖氨酸、第336位的天门冬酰胺、第338位的异亮 氨酸也都是决定致病力的分子基础。

    (二)缺损干扰颗粒(Defective-Interfering particles,DI颗粒)

    把正常的病毒称为“标准病毒”,把那些形态不同、基因组有缺陷、且又干扰正常病毒复制的病毒称之为“缺损干扰病毒颗 ?!?;DI颗粒的形态比标准病毒短1/3~1/2,且呈非弹状形,有大段基因缺失,基因缺失甚至可达50%。其免疫原性较差。经过长期组织培 养或高浓度的脑内传代后,会产生较多的DI颗粒。这是在疫苗研究和生产中值得注意的问题。

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