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    科普知识

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    第四节 疫苗毒种物

    时间:2018-01-24

    选择狂犬病疫苗毒种的基本原则,首先应是固定毒,而且必须是第1血清型的狂犬病病毒,任何候疫苗候选毒株都必 须有详细的传代历史记录,必须能诱导机体产生抗街毒感染的?;ぷ饔?。种子病毒应相对稳定,主种子病毒在传10代内可以使用;必须满足的基本条件:1.毒种 应维持一致的表现,如接种在特殊细胞基质上的细胞病变或是噬斑的特征、抗原性,以及以特殊途径接种动物后能引出满意的抗体应答;2.该毒株必须能被标准的 抗狂犬病病毒血清所中和。

    一、我国使用的生产毒种

    (一)aG株:是我国现用的疫苗生产毒株,来源于北京株,该毒株于1931年由北平卫生事务所袁浚昌先生从捕杀的狂犬脑组织分离,经当时的中央防疫处技术 人员在家兔脑内连传50代所得的病毒(减毒经过见表4-6-3),命名为北京株狂犬固定毒。于1980年以前,我国曾此毒株作为羊脑疫苗的生产毒株。

    北京株在经家兔脑内再传100代后,于1965年开始,由武汉生研所等单位用此固定毒株通过地鼠肾细胞适应传代,传至68代时获得一株既能适应于原代地鼠 肾细胞,又具有与北京株固定毒免疫原相似的组织培养毒株,称为a系株。a系株的前10代在组织培养中的产毒高峰在30天,毒力滴度为 3.5lgLD50,11~36代产毒高峰缩短至15天,到44~68代时为5天,其毒力滴度为4.5lgLD50,用a系55代毒株感染豚鼠脑所得的毒 种称为aG株, aG株经感染豚鼠脑与单层细胞培养交替传代,获得毒力较稳定aGT种子株。经小动物和大动物(狗、猴)外周神经感染与中枢神经致病试验,结果表明aGT经 外周神经感染致病率比原固定毒北京株大大降低,而北京株仍保留20~30%的致病力。脑内感染的犬脑组织切片,北京株所致的重度病理变化比率为64%,而 aGT为15%;北京株所致的轻度病理变化占9%,而aGT为50%;故认定其外周神经致病性几乎完全丧失。

    以aGT为毒种制成试验疫苗,经皮下免疫狗、猴,其7、14、21、30天所产生的中和抗体滴度大大高于羊脑疫苗和北京株对照组。嗣后,此疫苗经大面积人 体临床试验,结果表明能完全?;け环瓒镆说娜颂?。此后我国全部使用此aGT毒株作为细胞疫苗生产毒种。

    (二)CTN株:该毒株于1957年分离自山东省淄博市死于狂犬病患者脑组织。在小鼠脑内连续传代,当传至56代时(即CTN-M株)小鼠发病潜伏期从 11-14天缩短为3-6天,皮下致病力下降2.7lgLD50。其后CTN-M株又通过人胚肺二倍体细胞株连续传代共100代;当传至37代左右,其病 毒滴度提高了3.0~5.0lgLD50,命名为CTN-1-37。

    1994年,将二倍体细胞适应株CTN-1-7适应于Vero细胞,连续传代30代,第1代的毒力即可达到107 LD50/ml,25代以后毒力可达107.5 ~108.0 LD50/ml。脑内接种后的病理切片无包涵体,对家兔肌肉、脑内注射均不致病,对豚鼠、裸鼠、乳狗进行肌肉包括近神经部位接种均不致病。小鼠连续感染3 代,潜伏期均为6天;未发现毒性逆转现象。免疫学交叉试验结果显示:用aG株免疫血清中和后进行免疫原性试验,结果中和指数为1.7×105 LD50。CTN-l株与aG株的抗原性一致,且比CVS株更密切。

    用该毒种制备的实验性犬用活疫苗,经口服和肌注免疫接种41715头犬,未发现疫苗株的致病性,免疫效果和?;ちα己?,孕犬口服活疫苗无垂直感染。犬口服 30天后中和抗体可达2.59IU/ml,阳转率100%。35~60日龄乳犬口服1O个剂量的活疫苗,在3个月内的各时期分别杀犬取脑及唾液腺,分别在 BHK-21细胞和小白鼠脑内盲传2代进行病毒分离,结果均为阴性。证明该毒株已充分减毒,显示安全有效。

    1982年获卫生部同意将此毒种扩大使用。l984年,WHO狂犬病专家委员会第七次报告中,将我国CTN-l株认可为狂犬病病毒固定毒株,列为可用于生产疫苗的病毒株。

    二、国外使用的生产毒种

    (一)适应于鸡胚细胞培养的毒株:

    最有代表性的、适应于鸡胚细胞培养的毒种是Flury毒株,1940年Koprowski从因狂犬病死亡的女孩脑内分离的病毒称之为Flury毒株,将此 毒株连续在1日龄雏鸡脑内传138代,消除了其入侵唾液腺的能力;随后又在鸡胚卵黄囊传40~50代,又降低了其对外周神经的嗜性,对狗不致病,称之为低 代次鸡胚细胞培养适应毒株,简称为鸡胚低传代株(low egg passage,LEP)。其后,再在鸡胚传178代以上,至此,该毒株无论在神经内外接种都丧失了对动物的致病力,但对新生乳鼠和猴进行脑内接种仍有感 染性。现在人们将68代之前的毒株称为LEP,136代之后的毒株称为鸡胚高传代株(high egg passage,HEP)。

    1.日本制造的原代鸡胚细胞疫苗毒株就是来源于 Flury-HEP,Yoshino于60年代初,作1日龄鸡胚适应传代,最后由近藤将此毒株适应于原代鸡胚成纤维细胞,经多次选育出可作为疫苗的种子毒株。

    2.德国 Behring厂制造的原代鸡胚细胞培养精制疫苗所用的毒株为 Flury-LEP毒株,毒种来源于美国 ATCC提供的鸡胚第59代,适应于原代地鼠肾细胞共90代,以及适应于人二倍体细胞 WI-38共12代,其后再适应于原代鸡胚细胞。在原代鸡胚细胞适应的第25代(称 LEP-C25)作为人用疫苗的主种子毒。

    (二)适应于传代细胞培养的毒株:

    1. 适应于人二倍体细胞系的毒株:毒种为Pitman-Moore株(简称PM株),是固定毒,来自Pasteur株(简称PV株)。Wistar研究所从 1960年起筛选毒种,1962~1963年将此毒种适应于人二倍体细胞系 WI-38,共传52代(在1964年以前制备的疫苗,其毒种代次水平为47代)。并于52代作为种子毒。病毒滴度可达到10-6.7LD50/ml。

    2. 适应于Vero细胞系的毒株:毒种来源于Wistar的PM株,简称Wistar株。由法国Merieux研究所将Wistar株适应于Vero细胞系和人二倍体细胞系MRC-5,称为PM1503 3M株。

    3. Evelyn-Rokitnicki-Abelseth 毒株(简称ERA株):1984年加拿大的Pasteur- Merieux-Connaught公司使用此毒株用于生产人二倍体细胞疫苗。

    PV株繁衍谱系,在兔脑内传代大于1500代;1940年Habel将PV株引入美国。Wistar研究所从NIH获得PV-11株,经两代兔脑传代,在 WI-38细胞传47~52代作为主种子毒,称为PM株。1966年再转至Merieux研究所,Merieux研究所将其经兔脑传代并适应于Vero细 胞系和人二倍体细胞系MRC-5。目前PM株已经适应于三种不同的细胞系上。

    三、检定用的攻击毒株

    攻击用毒株一般采用challenge virus standard (CVS) 株。CVS株来源于PV株,它有许多亚系,例如CVS-11、CVS-24、CVS-27、CVS-F3等。CVS-24株是高神经致病性的野型 (neuropathogenic wild-type)毒株,它适应于小鼠脑内传代;现是疫苗检定用的标准攻击毒株。

    四、兽用疫苗所使用的毒种

    1.SAD(Street-Alabama-Duffering)候选毒株及其衍生毒株,1935年在美国Alabama州从疯狗脑中分离到的一株狂犬病 街毒,经小鼠脑传代成为固定毒;再经原代地鼠肾细胞、鸡胚、牛肾细胞和猪肾细胞传代后,成为疫苗候选毒株,简称为SAD株。SAD株再经猪肾细胞传 35~45代,称为ERA株。如果SAD株再经原代地鼠肾细胞在32℃条件下培养传40~107代,成为疫苗候选毒株Vnukovo-32。

    (SAE克隆株是来自SAD B19株,通过蚀斑克隆、小鼠接种和在BHK-21细胞获得的。SAE株:含11928个核苷酸;其中含有5个结构基因,从3’端起,依次为 核蛋白基因含1353个核苷酸、非结构蛋白(NS、或称P、M1)基因含990个核苷酸、基质蛋白(M2)基因含803个核苷酸、糖蛋白基因含1575个 核苷酸、大蛋白(L)基因含6474个核苷酸。)

    2.减毒PV株。

    3.其它减毒疫苗株:SAD B19株、Flury-HEP、SAG1、SAG2株(21),均为通过动物或细胞传代突变获得的口服疫苗毒株。

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