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    科普知识

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    第五节 现行疫苗的制造与检定

    时间:2018-01-24

    据2002年WHO的报告,目前,在世界上使用的狂犬病疫苗既有脑组织疫苗,如主要在第三世界使用的山氏疫苗 和弗氏疫苗,又有细胞培养疫苗及其精制纯化疫苗。这是病毒性疫苗中的奇观,其它疫苗都是发展新一代后,就淘汰前一代,只有狂犬病疫苗是一直在发展,而老疫 苗又未完全被淘汰。这可能由于制造技术发展、科学知识水平以及受经济能力限制的制约结果。脑组织疫苗除可诱发变态反应性脑脊髓炎之外,现在科学试验还证 明,人的新变异型克雅?。∟vCJD)与接种羊脑组织疫苗有关,完全淘汰脑组织疫苗为期不远了。我国现在使用精制细胞培养疫苗,与发达国家同步。

    主要介绍WHO向全世界推荐或国际上公认的四种疫苗,下面按病毒培养的细胞基质分类叙述之。

    一、原代地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)及其精制疫苗

    目前,我国、加拿大、俄罗斯等国家都采用此细胞培养疫苗。原制疫苗的制造原理及工艺大同小异,以我国现行生产工艺流程为例。我国的原代地鼠肾细胞疫苗经历 过原制(佐剂)疫苗、其后是浓缩疫苗、最终发展成为精制疫苗,前两种疫苗剂型已被淘汰。为了便以理解,故将三种疫苗剂型分开叙述。

    1,原制疫苗及其佐剂疫苗:

    用aGT株的豚鼠脑病毒培养物(选自有典型狂犬病表现的豚鼠)作为生产用毒种,以1:1500左右的病毒量感染已长成单层的原代地鼠肾细胞,温度37℃吸 附3天,倾倒去除病毒毒种与细胞生长液,用 Hanks液洗涤细胞,再用 SMl或199培养液为维持液培养,33~37℃培养4天,收取病毒培养液,加福尔马林使最终浓度为 l/5000,37℃灭活24~48小时,然后过滤去除细胞碎片,合并,加 l/万的硫柳汞防腐,即为疫苗原液。培养温度的不同,病毒产毒高峰时间亦不同,例如,33~35℃培养,病毒产毒高峰期在5~6天,37℃培养则在第4 天。疫苗原液加氢氧化铝使最终浓度为0.5mg/ml,制成佐剂疫苗。经无菌试验、安全试验、效力试验合格后,即行分装、包装制得疫苗成品。此疫苗经十多 年的应用,对控制狂犬病的发病率和降低疫苗接种后的副反应起到较大的作用,但是,由于较难保证疫苗的效力恒定在每剂2.5IU以上,而且稳定性亦不佳,故 增加浓缩工艺流程以确保疫苗的效力能达到每剂2.5IU以上。

    2,浓缩疫苗:

    疫苗原液经过5~15倍浓缩后,加氢氧化铝制成佐剂浓缩疫苗(也可称为液体浓缩疫苗)。如果不加氢氧化铝而加明胶蔗糖等冻干?;ぜ猎傩卸掣?,则成冻干浓缩疫苗。

    浓缩疫苗经过一段时间(约7年)的人体使用和观察之后发现,虽然其所引出的?;ばЧ灾?,但此疫苗的副作用也随之增强,例如:局部疼痛及红肿、发热、全身 过敏性反应的发病率增高。目前我国已经淘汰原制佐剂疫苗及浓缩疫苗。

    3,精制疫苗:

    因上述情况所致,我国于1990年代下叶开始,进行地鼠肾细胞培养精制人用疫苗的研制及临时试验,并于1990年代末得到批准生产。此疫苗仍然使用aGT 毒株,在原代地鼠肾细胞中培养,在收取病毒培养液后,经过多步骤纯化,例如,经沉淀浓缩、离子交换柱层析等方法纯化,然后除菌过滤,在此工艺流程后,如果 加入氢氧化铝则成液体佐剂型精制疫苗;如果添加冻干?;ぜ猎傩卸掣啥傻脑虺贫掣删埔呙?。在成品检定中增加疫苗的纯度检测项目,如病毒蛋白含量、细胞 DNA残存量。

    一般说来,原制疫苗刺激机体产生抗体较快,但抗体维持时间短;佐剂疫苗刺激机体产生抗体较慢,但抗体维持时间长。

    二、人二倍体细胞疫苗(HDCV)

    HDCV是目前国际上公认安全性及免疫效果较好的一种疫苗。有人认为如果使用得当,能提供100%的?;?;现在北美和西欧等国都使用之。

    1.美国 Wistar研究所制作法:毒种为PM L503株,人二倍体细胞系 WI-38。

    工艺流程:将毒种与细胞悬液混合。加生长液后分装在培养瓶内,静止培养3天,形成单层后,用胰酶消化感染细胞,加入正常细胞,再加生长液静止或旋转培养 2~3天,洗涤细胞,替换之维持液旋转培养。间隔3~4天收获病毒悬液,连续收3~4次,在此期间,仍可将细胞消化分散后继续传代,再将所收的病毒悬液合 并,微孔过滤去除杂质,然后超滤浓缩,浓缩物用磷酸三丁酯灭活。再过滤,加冻干?;ぜ梁蠖掣?,即成为成品。

    2. 法国 Merieux研究所制作法:是Wistar研究所法的改良工艺。毒种为Wistar株,人二倍体细胞系MRC-5。细胞种子为第16代,生产用细胞为第27代。

    工艺流程:将毒种与细胞悬液混合,种毒量为1 LD50/20~25个细胞,以37℃磁力搅拌15分钟,加生长液后于37℃培养3~4天,形成单层后,用胰酶消化感染细胞,以一分二的扩增法再加生长液 于37℃培养3~4天,洗涤细胞,替换EBM维持液,于35℃培养。间隔3~4天收获病毒悬液,连续收3~4次,合并病毒悬液,微孔过滤后超滤浓缩,浓缩 物用β-丙内酯灭活26小时。再过滤,加冻干?;ぜ梁蠖掣?,成为成品。也可采用蔗糖梯度密度区带离心法纯化,然后再灭活和超滤浓缩,经适当的稀 释后加?;ぜ两卸掣?。

    现已证明,β-丙内酯会造成人白蛋白改性(modified),尤其是白蛋白高浓度时。改性的白蛋白会引出IgE类抗体,从而引发过敏反应;可能也是一种自身抗体。

    三、原代鸡胚细胞疫苗(PCECV)

    1.日本制造的原代鸡胚细胞疫苗,所使用的毒种是 Flury-HEP。

    工艺流程:选用7日龄无特殊致病因子(SPF)鸡胚,制备成原代鸡胚细胞,37℃培养形成单层后,按1:100(病毒:细胞)的种毒量感染吸附,37℃1 小时后更换液体,用无血清199培养液作维持液,于35℃培养4~6天后,收取病毒悬液,病毒滴度可达到10-6~10-8LD50/ml,合并后过滤澄 清,用0.04%β-丙内酯灭活。其后进行2~20倍的超滤浓缩。浓缩物内加明胶、乳糖、L-谷氨酸钠作为?;ぜ?,分装1mL为一剂量,冻干后 为成品。纯化疫苗则采用在浓缩后进行超速离心法纯化。

    按0、28、160天免疫接种一次,第一针接种二周后,有90%的志愿者的抗体平均水平为1:40,第二针接种100%的志愿者抗体平均水平为1:100。

    2.德国 Behring厂制造的原代鸡胚细胞培养精制疫苗,毒种是Flury-LEP毒株。

    工艺流程如下:选用9日龄的SPF鸡胚,剪碎消化,混合接种毒种,35℃旋转培养,第4天后收第一次病毒悬液,第6天与第8天各收一次病毒悬液,3次收的 病毒液合并,其病毒滴度为107.0TCID50/ml以上,用β-丙内酯4℃灭活20小时,用微孔过滤法或低速连续流离心法去除细胞碎片,用 连续流密度梯度速率区带离心法部分纯化与浓缩,收取36%的蔗糖带,然后据抗原含量来稀释浓缩物,加?;ぜ?,?;ぜ聊诤?%的人血白蛋白和降解明胶等成 份,冻干,每剂为lmL,效价单位大多在>7.5IU/剂。

    此疫苗的优点,是原材料来源充足,工艺不复杂,且能达到较高的病毒滴度,经纯化后, 几乎不含杂质,稳定性好(55℃四周效价稍降),但与血清联合使用后,抗体应答水平不如人 二倍体疫苗,单独使用鸡胚细胞疫苗,其抗体维持时间及其GMT亦较人二倍体疫苗为差。

    四、传代细胞系疫苗

    1,法国 Merieux研究所于1984年报导了生产精制Vero细胞培养狂犬病疫苗的结果。 他们采用微载体(Microcarrier beads)系统作为细胞培养悬浮固定物,并利用一系列的生物反应器来控制细胞与病毒的培养条件。

    Vero细胞从培养开始,就能吸附到微载体小珠上,3天以后就能铺满整个微载体小珠,再用 PM1503-3M病毒株感染在微载体上的细胞,病毒种毒量约1LD50/1000个细胞,维持液为含0.3%人血白蛋白的EMEM,37℃培养。从第6 天起收获病毒悬液,连续收5~6次,整个收毒期为3周。所收获的病毒悬液其感染滴度较为恒定,一般在106.6TCID50/mL以上。病毒原液合并后微 孔过滤澄清,并用膜式滤器浓缩10~25倍,浓缩物再以1:4000的β-丙内酯4℃灭活,然后再次超滤分子洗净,以蔗糖梯度密度区带离心法与 柱层析法纯化。加5%人血白蛋白作?;ぜ?,冻干,每剂量0.5ml。

    细胞主种子为124代,从生产用细胞种子第137代的单一安瓿保存的Vero细胞种子,逐级扩增细胞量直至达到生产常规的500~1000升的培养量,此 过程需用一系列生物反应器经5级细胞放大培养,约需一个月时间,到感染病毒时细胞的代次142代。这些生物反应器都是自动调节温度、溶氧、pH、CO2、 压力、搅拌速度等。从种子细胞到生产常量细胞,均需作细胞核学检查及生长特征鉴定。成品检定除常规检测项目外,尚需作下述二方面的检测。第一、肿瘤源性试 验,用106个Vero细胞接种于经抗胸腺细胞血清处理过的新生大鼠(或裸鼠等免疫低下动物),同时用 Hela或Hep-2或KB细胞作为阳性对照。第二、测定痕量的细胞DNA用32P标记的 Vero细胞 DNA作探针,作 DNA-DNA分子杂交实验。

    据 Fournier等人的报导,此疫苗的稳定性较好。4℃可贮存24个月。57例的临床试验表明,5针次抗体反应经ELISA法测定,7天抗体阳转率为23%,GMT为0.23IU,14天为84.5%,抗体 GMT为1.82IU,30天阳转率为100%,抗体 GMT为3.07IU。

    法国 Merieux研究所于1998年又报道了改变离心法而仅用柱层析法纯化疫苗的临床使用结果(15)。为了降低人血白蛋白等非病毒的蛋白含量,其工艺改进 还采用先纯化后灭活病毒,以保证减少Ⅰ、Ⅲ型变态反应。使用改进工艺前疫苗(PVRV)的167人,使用改进工艺后疫苗(CPRV)的167人,以三针法 免疫,于第42天时,所有受试者的VNab滴度均大于0.5IU;CPRV组的GMT为23.0IU,PVRV组则为29.6IU。但CPRV组的全身反 应率却比PVRV组低。

    2,我国的精制 Vero细胞培养狂犬病疫苗,所用的毒种既有aG株又有CTN株。

    工艺流程与法国巴斯德- Merieux研究所的疫苗制造工艺流程大致相同,但尚未用生物反应器培养细胞以大规模地成批生产疫苗;目前大都采用转瓶法培养细胞,从单一安瓿保存的 Vero细胞种子,逐级传代扩增细胞到生产常规的10升/瓶的培养量,需经过至少5~10个代次。接种病毒37℃5天后,开始收获病毒培养液,每3天收获 病毒培养液一次,可连续收获病毒培养物3~5次以上,其病毒滴度可达106.5~107.5LD50/ml以上。病毒灭活剂既可用福尔马林又可用 β-丙内酯,而且纯化工艺亦有所不同,例如,我国的纯化工艺是采用柱层析法。成品为1ml规格的液体疫苗?;褂凶艏列鸵禾逡呙?。

    用于生产的传代细胞需建立多级细胞种子库;而且种子库细胞及生产过程中每一代次细胞均需进行细胞核学检查。目前我国对Vero细胞的最高传代代次限制在160代。

    据我国临床前试验与临床试验的结果分析,每剂疫苗效力都达到5IU以上,稳定性好,37℃2周疫苗效力下降不明显;4℃保存可18个月。初步的临床试验结 果表明,采用CTN株的疫苗其抗体阳转率及中和抗体滴度都较好。40天时,抗体阳转率为100%,中和抗体GMT为9.62~11.89IU,法国的维尔 博疫苗为对照组,40天时,其抗体阳转率为100%,中和抗体GMT为10.09IU。

    用传代细胞生产狂犬病疫苗的优点是,不受动物来源的制约、如果采用生物反应器培养细胞与病毒则能大规模工业化生产且可自动化控制,各批质量较恒定,有利于 质量控制。生产成本比人二倍体疫苗低,质量可与人二倍体疫苗相媲美。但设备的一次性投资较昂贵,生产周期较长,一旦出现污染经济损失也大。

    五、检定方法与标准

    在我国,从1990年版中国生物制品规程开始,明确规定狂犬病疫苗的效力检测要求使用 NIH法,标准是每剂效力须≧2.5IU。 NIH是一种变量免疫定量攻击的效力测定法,虽存在一些问题,但目前仍是最可靠的方法。由检定所发放攻击用毒种(CVS株)及参考对照疫苗。标准品稳定可 减少试验误差。各国均用NIH法检测疫苗的效力,而且,有些国家还采用双份检测法,结果取平均值作为疫苗的效力单位。

    NIH法是将待检疫苗及参考疫苗分别以不同浓度的疫苗免疫小鼠,间隔一周共免疫2次,于第一次免疫后的14天时,以定量的CVS攻击,2周后判断结果,从而求50%有效剂量(ED50),按以下公式计算效力单位。

    待检疫苗效力=待检疫苗ED50/参考疫苗ED50×待检疫苗(ml/剂)/参考疫苗(ml/剂)×国家参考疫苗效价

    参考疫苗的 IU应以每毫升为单位。

    我国在2000版中国生物制品规程中明确将传代细胞系株列为可用于生产疫苗的细胞基质,并制定了相关的检定原则以及相关疫苗的检定规程,同时也适当放宽了 细胞性DNA在疫苗中残存含量的限度,现在的要求是每剂10ng为最高限度。

    疫苗的其他质量标准与要求,可参阅1990年与2000年版的中国生物制品规程。

    在国外,有些厂家进行半成品效力检定时,利用单向免疫扩散法、放射免疫法以及抗体结合试验(ABT)测定病毒或糖蛋白含量,作为内控质量指标。

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